1. ASSISTANCE A L’ECLOSION EMBRYONNAIRE

Auteurs :

Martine DUMONT(1,2) ; P. COHEN-BACRIE (1), A. LE MEUR (1), A. HAZOUT (3), F. OLIVENNES(4), R FRYDMAN (4).

AMP EYLAU

1. Laboratoire d’Eylau – 55, rue Saint Didier 75116 PARIS
2. Clinique P . CHEREST ,5, rue Pierre CHEREST 92200 NEUILLY SUR SEINE
3. Clinique de la Muette 46-48, rue Nicolo 75116 PARIS
4. Hôpital Antoine BECLERE, 157, rue de la Porte de Trivaux 92141 CLAMART

Ces dernières années deux techniques ont été proposées pour tenter d’augmenter le taux d’implantation des embryons obtenus par fécondation in vitro. L’une de ces techniques est la culture prolongée d’embryons soit sur tapis cellulaires soit en milieux simples, l’autre est l’éclosion assistée qui consiste à perforer la zone pellucide des embryons précoces pour faciliter leur éclosion ultérieure.

In vivo, la perte de la zone pellucide par le blastocyste est un phénomène étroitement lié à l’implantation : si cette étape du développement embryonnaire intervient en retard ou ne se fait pas, alors l’implantation embryonnaire sera compromise. Le mécanisme d’éclosion de l’embryon n’est pas clair. La majorité des informations sur l’éclosion des blastocystes a été obtenue à partir d’études in vitro car l’éclosion naturelle (in vivo) est difficile à observer.

In vitro, l’expansion du blastocèle des embryons de mammifères s’accompagne d’un amincissement de la zone pellucide (ZP) puis celle-ci se rompt : l’excroissance du trophectoderme apparaît à l’extérieur de la ZP et l’éclosion se poursuit et s’achève par une large ouverture de la ZP.

Des études menées in vitro chez la souris ont montré que si l’on met des inhibiteurs de protéases dans le milieu de culture des embryons ; on inhibe l’éclosion, puis PERONA et WASSARMAN ont montré que les cellules du trophectoderme produisaient une protéine trypsine like qu’ils ont appelé " strypsin " (1) SWADA et CollL ont également identifié une protéine trypsine like dans le milieu de culture de blastocystes éclos de souris.

En filmant le développement embryonnaire in vitro, COLL, a montré que chez la souris ; il y avait des cycles de contraction et ré-expansion du blastocyste juste avant l’éclosion ; d’où l’idée que l’expansion du blastocyste devait exercer une pression sur la ZP favorisant ainsi l’amincissement de la ZP et l’éclosion (2).

Chez 6 autres espèces : le cobaye, le hamster, le singe, les bovins, les équins et l’humain ; cette activité cyclique s’accompagne de l’apparition des " TEP " ( projections cytoplasmiques émanant du trophectoderme et qui traversent la zone pellucide). Les " TEP " qui apparaissent uniquement au stade blastocyste et dans une région précise de l’embryon sont également soumis à des cycles rapides d’extension et de rétraction. Leur présence in vivo a été montrée chez le cobaye et le hamster. Les " TEP " seraient impliqués dans un ou plusieurs événements clés du développement précoce tels que : éclosion embryonnaire, attachement et/ou implantation du blastocyste. (GONZALES et Coll, 1996 (3))

Le milieu utérin n’est pas indispensable à l’éclosion proprement dite puisque la perte de la ZP peut se produire dans un environnement extra-utérin ; que ce soit un vivo (oviducte de souris ; chambre antérieure de l’œil ; grossesses extra-utérines chez la femme) ou in vitro.

Cependant il est probablement indispensable à une implantation réussie in utéro, c’est-à-dire à la survenue d’une éclosion embryonnaire en phase avec un endomètre réceptif. En effet, chez la souris, Mc LAREN a montré que l’environnement utérin pouvait avoir des conséquences sur le temps d’éclosion des embryons. Si l’implantation embryonnaire est interrompue,par l’ovariectomie au jour 2 ou 3 de la gestation, ou par la lactation ; autrement dit si l’embryon est soumis a un environnement hormonal " neutre " ou dominé par la progestérone ; l’éclosion du blastocyste est différée de 24 heures et la ZP est retrouvée vide, non dissoute. Si par ailleurs l’implantation est induite en injectant de petites quantités d’œstrogènes ; la lyse de la ZP intervient dans les 18 heures qui suivent les injections. Ces expériences suggèrent donc que l’utérus produit un facteur lytique oestrogéno - dépendant responsable de la lyse de la ZP.

Une étude plus récente de GONZALES et BAVISTER chez le hamster, comparant l’éclosion spontanée in vivo et in vitro, montre également qu’in vivo il y a lyse complète de la ZP.

Toutes ces observations suggèrent que in vivo, deux mécanismes interviendraient dans la perte de la ZP :

- Un facteur lytique utérin hormono - dépendant.

- Un procédé actif d’éclosion engagé par le blastocyste indépendamment d’un stimulus hormonal.

L’hypothèse que des défauts d’éclosion pouvaient être responsables d’échecs d’implantation a été émise par COHEN et Coll en 1990 (4) suite à 2 observations :

1 - L’analyse rétrospective de l’aspect morphologique des embryons et du résultat de leur transfert a montré que les embryons à ZP épaisse s’implantaient beaucoup moins que les embryons à ZP fines et irrégulières (10% contre 25%)

2 - Les embryons issus d’une fécondation assistée par PZD ( " Partial Zona Dissection " ) s’implantaient mieux que les embryons à ZP intacte. D’ou l’idée que la capacité à éclore des embryons pouvait être augmentée par un amincissement artificiel de la ZP ou par la création d’un trou dans la ZP .

D’autre part, on sait que les conditions de culture in vitro ; ou un vieillissement in vivo des ovocytes peuvent induire un " durcissement de la zone pellucide, c’est à dire une augmentation de la résistance de la ZP à sa dissolution par différents agents chimiques et enzymatiques (souris, femme)

C’est une technique mécanique qui consiste à embrocher la ZP avec une aiguille de verre et à frotter le segment sous tendu contre la pipette de contention, on réalise alors une incision de taille variable.

L’application d’une solution de tyrode acide (pH 2,3) permet de dissoudre la ZP ; réalisant ainsi un orifice rond et large.

Le principe est le même que celui de la technique au tyrode acide, cependant cette technique est très coûteuse.

- Au tyrode acide (souris)

- Au laser (femme)

Une étude in vitro sur les embryons de souris, comparant la technique de perforation au tyrode acide (TA) a montré que la taille de l’ouverture est déterminante pour le devenir de l’embryon. Si par la technique PZD, on réalise une incision trop étroite £ 5µm ; on obtient seulement 22% d’éclosions complètes (contre 72% si l’incision est de 11 à 25µm) ; la plupart des embryons pouvant être piégés dans la zone pellucide conduisant ainsi à des anomalies d’éclosion.

Deux études portant sur la culture d’embryons humains frais (5) ou congelés(6) après éclosion assistée par PZD n’ont pas retrouvé d’anomalies d’éclosion des embryons.

Selon COHEN et Coll, la technique de perforation au tyrode acide semble la mieux adaptée car elle permet de réaliser des trous de taille constante ; suffisamment larges et ronds pour permettre une éclosion totale des embryons sans traumatisme (92% d’éclosions complètes).

Cette technique est par ailleurs utilisée pour le diagnostic pré-implantatoire des embryons par HANDYSIDE et COLL (7) et permet un taux d’implantation embryonnaire satisfaisant.

Le modèle souris n’est pas un modèle directement transposable à l’homme puisque tous les embryons cultivés in vitro à partir du stade 2 cellules peuvent éclore.

Ce modèle permet surtout de montrer l’éffet délétère éventuel d’une technique de Hatching mais pas son éffet bénéfique.

Il était donc nécessaire de créer un modèle d’embryons ayant un développement normal excepté pour leur capacité à éclore.

Deux modèles souris ont été proposés pour l’inhibition de l’éclosion embryonnaire in vitro :

1- La culture d’embryons dans des conditions non optimales ; culture en milieu sans protéines induisant un durcissement de la zone pellucide et une inhibition de l’éclosion (10% d’éclosions complètes contre 87% dans le groupe témoin) (8).

2- La destruction d’un blastomère au stade 4 cellules afin d’obtenir des blastocystes plus petits dont le taux d’éclosions in vitro est réduit (58% contre 83% chez les témoins) (9).

Dans ces 2 modèles le défaut d’éclosion est corrigé par une technique d’éclosion assistée au tyrode acide (amincissement ou perforation de la ZP) permettant de restaurer un bon taux d’implantation in vivo (26% à 37%)

L’équipe pionnière de COHEN et Coll (4,10) dans une étude portant sur 330 couples et plusieurs essais randomisés a montré que :

L’éclosion assistée appliquée a une population non sélectionnée n’augmentait pas significativement les taux de grossesses et d’implantation.

Chez les femmes d’âges inférieur à 39 ans et à FSH normale ; seuls les embryons ayant un ou plusieurs critères morphologiques défavorables pour l’implantation (ZP ³ 15µm ; moins de 5 cellules à J3 , excès de fragmentation > 20%) doivent être soumis à l’éclosion assistée.

Seules les femmes d’âge supérieur ou égal à 39 ans et/ou à FSH élevée (> 15 UI) pouvaient bénéficier de l’éclosion assistée appliquée sur la totalité des embryons transférés.

Parmi les études publiées (tableau 1) seules trois d’entre elles rapportent un meilleur taux de grossesses et d’implantation dans le groupe de patients avec éclosion assistée. Dans notre expérience (tableau 2) les techniques d’éclosion assistée ne semblent pas avoir d’éffets délétères sur les embryons mais ne semblent pas non plus améliorer le taux d’accouchement dans cette catégorie de patientes. Ces résultats corroborent ceux de BIDER et Coll, 1997 , qui ne montrent pas de différence significative entre le groupe contrôle et le groupe " hatching " pour lesquels ils trouvent respectivement : 3,8% d’enfants nés par transfert contre 3,3%.

Seul COHEN et Coll (4) ont rapporté une petite étude randomisée portant sur 30 patientes. Cette courte série a permis d’obtenir 26% d’implantation par embryon transféré dans le groupe éclosion assistée contre 10% dans le groupe témoin.

Aucune autre série plus importante n’a été publiée depuis l’obtention de ces résultats préliminaires.Une étude randomisée en cours dans notre équipe, donne l’avantage au groupe " hatching " en terme de grossesses cliniques par transfert. Nous continuons l’étude.

Le tableau 3 montre que seules 2 équipes : OBRUCA et Coll et ANTINORI et Coll obtiennent des augmentations significatives des taux de grossesses et d’implantation chez des femmes ayant eu plusieurs transferts d’embryons avec échecs d’implantation. Ces 2 groupes utilisent le laser pour réaliser l’éclosion assistée.

Seules 2 équipes ont publié des résultats ( tableau 4). CHECK et Coll obtiennent une différence significative dans les résultats entre le groupe témoin et le groupe expérimental. Cependant, il est difficile de dire si l’amélioration provient exclusivement de l’éclosion assistée ou bien si elle provient aussi de la modification du protocole de congélation - décongélation.

D’après les études de COHEN et Coll (4) et HELLEBAUT et Coll, l’éclosion assistée appliquée à une population non sélectionnée n’améliore pas les résultats de façon significative. Par contre, selon les auteurs ; elle pourrait avoir un intérêt chez les femmes âgées et/ou à FSH élevée et également chez les femmes à échecs répétés d’implantation.

Il est difficile de conclure sur l’intérêt de l’éclosion assistée car la différence de méthodologie entre les équipes rend difficile l’interprétation et la comparaison des résultats pour plusieurs raisons : différences dans la sélection des patients, le choix de la technique, le jour de l’éclosion assistée, le traitement de la phase lutéale (utilisation de corticoïdes et antibiotiques)

Il semble indispensable de faire des études cliniques randomisées avec une méthodologie comparable à celle des équipes les plus performantes.

COHEN et COLL TA(J3) + n=99 16% I/E

1992 Hum . Reprod. n=59 3%I/E

Vol.7, N°5

OLIVENNES et COLL PZD(J2) n=45 cycles 22,2% GT

1994 Contracept 11,1% I/E

Fertil. Sex Vol 22, N° 9

STEIN et COLL PZD(J2) + n=46 23,9% G/P

1995 Fertil. Steril n=43 7 % G/P

Vol 63 pp 838-841

SCHOOLCRAFT TA(J3) + n=38 22% I/E

et COLL 1995 47% Acc/P

J.of . Ass Reprod . And n=28 6% I/E

Gen . Vol 12, N° 9 11% Acc/P

BIDER et Coll, 1997, Hum. TA(J3) n=312 cycles 3,8% BB/T

Reprod. Vol .12,N°2 n=274 cycles 3,3% BB/T

+ : Différence significative entre groupe expérimental et groupe témoin

TA : Tyrode Acide ;

" PZD " : Dissection Partielle de la ZP,

n : nombre de patients ;

P : Patients, I : Implantation ;

E : Embryon ;

G : Grossesses.

PZD TA

AMP EYLAU

OBRUCA et COLL Laser (J2) + n= 129 33% G/T

OLIVENNES et SELVA PZD (J2 ou J3) n= 37 24,3% G/T

STEIN et COLL 1995 PZD (J2) n=154 20,8% G/P

ANTINORI et COLL 1996 Laser(J2) + n=200 36,4% G/P

13,7 % I/E

PERONA RM ; WASSARMAN PM. Mouse blastocyst hatch in vitro by using a trrypsin-like proteinase associated with celles of mural trophectoderm Dev . Biol. 1986 :114 : 42-52

COLE RJ ; Cinemicrographic observations on the trohphoblast and zona pellucida of the mouse blastocyst. J. Embryol. Exp ; Morphol. 1967 : 17 : 481-490.

GONZALES . DS JONES JM, PINYOPUMMINTR T. , CARNEVALE EM, GINTHER O.J, SHAPIRO SS, BAVISTER BD, Trophectoderm projections : A potential means for locomotion, attachment and implantation of bovine, equine and human , blastocysts. Hum.Reprod 1996 : Vol 11, N° 12, pp 2739-2745

COHEN J, ALIKANI M ; TROWBRIDGE J ; ROSENWAKS Z ; Implantation enhancement by selective assisted hatching using zona drilling of human embryos with poor prognosis. Hum. Reprod. 1992 :Vol 7,5 : 685- 691

DOKRAS A ; ROSS C ; GOSDEN B ; SARGENT I.L ; BARLOW DH ; Micromanipulation of human embryos to assist hatching Fertil . Steril.1994 : Vol 61,3 : 514-520

MANDELBAUM J ; PLACHOT M ; JUNCA AM ; SALAT BAROUX J ; BELAISCH-ALLART J ; COHEN J Effets d’une dissection partielle de la zona pellucide (PZD) sur le développement et l’éclosion in vitro d’embryons humains congelés. Contracept. Fertil. Sex. 1994 :Vol 22,5 352.

HANDYSIDE AH ; KONTOGIAMI EH ; HARDY K ; WINSTON RML ; Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y. Specific DNA amplification . Nature 1990 :344 : 768-770.

ALIKANI M ; COHEN J ; Micromanipulation of cleaved embryos cultured in protein free medium : a mouse model for assisted hatching J. of Exp. Zool.1992 : 263 : 458-463.

GORDON JW ; DAPUNT U ; A new mouse model for embryos with a hatching deficiency and its use to elucidate the mechanism of blastocyst hatching. Fertil. Steril.1993 : Vol 59, 6 : 1296-1301.

COHEN J ; Assisted hatching : indications and techniques. Acta Europaea Fertilitatis .1993 : Vol 24, 5 : 215-219

HELLEBAUT.S ; DE SUTTER P ; ONGHENA A ; DOZORTSEV D ; QUIAN C ; DHONT M . Does assisted hatching improve implantation rates after IVF or ICSI in all patients : a prospective randomized study. J. Ass . Reprod. Gen.1996 : Vol 13,1 : 19-22

M. DUMONT(1,2), P.COHEN-BACRIE (1), J. TESARIK (1), A. LE MEUR (1), F.X. AUBRIOT(2), S. DOUARD (2), M. GLISSANT (2), A. HAZOUT (2), A. LAFFY (2). A. STANOVICI (2), M. ADJIMAN (2), V. IZARD (2).

L’ICSI constitue une avancée spectaculaire dans le traitement de la stérilité masculine. Avec cette technique quelques spermatozoïdes vivants (le plus souvent mobiles), éjaculés ou prélevés dans le tractus génital de l’homme suffisent pour réussir à concevoir un enfant.

Les cellules du cumulus sont dissociées après incubation des ovocytes, pendant 30 secondes à 1 minute, dans du milieu de culture contenant de la hyaluronidase ; Les cellules périovocytaires sont ensuite retirées par aspiration-refoulement des ovocytes dans une micropipette en verre de 200 µm de diamètre. Les ovocytes abondamment rincés dans du milieu de culture sont ensuite observés au microscope inversé pour noter leur stade de maturation ; puis ils sont incubés en milieu B2 de Ménézo ou milieu BM1 (Ellios-Bio media) pendant 2 à 3 heures dans un incubateur à 37°C, sous atmosphère humide à 5% de CO2. Seuls les ovocytes en métaphase II seront micro-injectés

Les spermatozoïdes utilisés pour l’ICSI ont différentes origines. Ils proviennent soit d’un éjaculat, soit d’un prélèvement de fluide épididymaire, soit d’une biopsie testiculaire. Ils peuvent également avoir subi une cryoconservation avant d’être utilisés.

Après examen au microscope ; tout ou partie du sperme est lavé par centrifugation à 1800 g pendant 5 minutes avec 5 ml de Earle’s ou solution saline de tyrode puis le culot est déposé sur un gradient discontinu de percoll à 2 couches (45%, 90%) et centrifugé à 400 g pendant 20 minutes. La fraction 90% est ensuite lavée avec 5 ml de Earle’s par centrifugation à 1800 g pendant 5 minutes. Le culot de spermatozoïdes est resuspendu dans du Earle’s – 3 % BSA ou dans du milieu BM1 et gardé dans l’incubateur à CO2 jusqu’au moment de l’injection intra-cytoplasmique.

Lorsque le sperme est trop pauvre en spermatozoïdes (cryptozoospermie), un seul lavage est pratiqué, par centrifugation à 1800 g pendant 5 minutes avec 5 ml de Earle’s. Puis le culot est incubé en Earle’s –3% de BSA ou en milieu BM1. C’est cette même préparation qui est utilisée pour les paillettes de spermes congelés.

Le fluide épididymaire est dilué dans les milieux B2 ou BM1 et déposé sur un gradient discontinu de percoll à 3 couches (50% - 70% -90%). Après centrifugation à 400 g pendant 20 minutes les différentes fractions sont lavées avec 4 ml de Earle’s par centrifugation à 400 g pendant 10 minutes. Puis le culot obtenu avec chaque fraction est dilué avec du Earle’s – 3% BSA ou du BM1 et incubé à 37°C. Chaque fois que cela est possible, une partie du sperme est congelée pour des tentatives ultérieures, si besoin.

La biopsie testiculaire est immergée dans 5 ml de Earle’s – Hépès ou BM1 puis fragmentée à l’aide de pinces fines. Les différents fragments sont ensuite écrasés entre deux lames de verre ; La suspension cellulaire est centrifugée à 400 g pendant 10 minutes puis le culot est dilué avec du Earle’s – 3% BSA et incubé à 37°C. Avant l’incubation on vérifie, au microscope inversé, qu’il y a bien présence de spermatozoïdes dans le culot.

Pour la micro-injection, on utilise un équipement spécialisé fixé sur un microscope inversé. Deux micropipettes sont indispensables pour réaliser l’injection : une micropipette de contention (diamètre interne : 20 µm) servant à tenir l’ovocyte et une micropipette d’injection (diamètre interne : 5 µm) pour prélever le spermatozoïde et l’injecter dans le cytoplasme de l’ovocyte.

Les deux micropipettes sont fixées sur des micromanipulateurs actionnés à distance par des commandes hydrauliques. Elles sont également reliées à des seringues permettant d’aspirer ou de refouler l’ovocyte et les spermatozoïdes.

Juste avant la micro-injection, les spermatozoïdes sont placés dans une goutte de Earle’s – hépès contenant 10% de polyvinylpyrrolidone (PVP). Le PVP augmente la viscosité du milieu, ce qui ralentit le mouvement des spermatozoïdes et facilite leur aspiration dans la pipette d’injection. Chaque ovocyte est déposé dans une goutte de 5 µl de Earle’s – hépès ou 5 µl de BM1 autour de la goutte de spermatozoïdes, le tout étant recouvert d’huile de paraffine légère. La boite de pétri est ensuite posée sur la platine chauffante du microscope inversé.

Au moment de l’injection ; l’ovocyte est maintenu dans le champ optique du microscope par une pipette de contention ; de telle sorte que , le globule polaire soit situé à " midi " ou à " 6 heures " pour éviter que la pipette d’injection ne touche le fuseau de métaphase II pendant son introduction dans le cytoplasme de l’ovocyte. Un spermatozoïde préalablement immobilisé est aspiré dans la pipette d’injection et injecté dans le cytoplasme de l’ovocyte.

Après la micro-injection, les ovocytes sont réincubés en milieu B2 ou BM1 à 37°C sous atmosphère humide à 5% de CO2.

Les pronucléï sont observés 16 à 18 heures après la micro-injection. Le transfert intra-utérin des embryons a lieu environ 48 heures après la micro-injection.

C’est ainsi que l’injection intra-ovocytaire d’un spermatozoïde provenant soit de l’éjaculat, soit de l’épididyme, soit du testicule, nous permet d’obtenir des résultats respectivement égaux à : 62%, 65,6%, 58% pour le taux de fécondation (2 PN/ovocytes intacts) ; 33,4% ; 39,5% ; 35,8% pour les taux de grossesses cliniques par transfert (voir tableau 1,2,3,4)

Ces résultats qui corroborent ceux des autres équipes internationales ne doivent cependant pas faire oublier que pour certaines indications cliniques, des difficultés subsistent pour produire un embryon viable, par ICSI.

Parmi ces cas plus difficiles à traiter, il y a :

• certaines tératozoospermies
• les azoospermies sécrétoires avec absence de spermatozoïdes testiculaires.

La mobilité du spermatozoïde est un facteur prédictif important de la fécondation par ICSI.

les akinétozoospermies relatives : aucune mobilité initiale puis obtention de quelques spermatozoïdes mobiles sur place après préparation et incubation du sperme. Dans ce cas l’ICSI est réalisable.

Les akinétozoospermies absolues : aucun spermatozoïdes mobiles, même après incubation. Dans ce cas ; l’injection de spermatozoïdes immobiles ne donne pas les mêmes résultats selon l’origine des spermatozoïdes. L’étude de NIJS et Coll, 1996, comparant les résultats de l’ICSI avec spermatozoïdes immobiles provenant soit de l’éjaculat, soit de l’épididyme, soit du testicule montre que le taux de fécondation : 53% est significativement moins élevé avec les spermatozoïdes immobiles de l’éjaculat que dans les deux autres groupes (épididyme : 60% ; testicule : 65%). Des grossesses évolutives ont été obtenues seulement dans le groupe avec injection de spermatozoïdes immobiles provenant du testicule (voir tableau 5).

Le problème majeur avec les akinétozoospermies en ICSI est de distinguer les spermatozoïdes vivants des spermatozoïdes morts. On peut essayer d’améliorer les résultats de l’ICSI avec spermatozoïdes immobiles de l’éjaculat en utilisant le test hypoosmotique (HOS-test : Hypo Osmotic Swelling-Test).Ce test simple permet de reconnaître les spermatozoïdes vivants qui réagissent à la solution hypoosmotique par un gonflement et un enroulement du flagelle. L’application de ce test dans huit cycles d’ICSI par CASPER et Coll, 1996, montre qu’il est possible d’obtenir un meilleur taux de fécondation (43% contre 26% sans le test) et un meilleur taux de grossesse ( voir tableau 6).

Nous n’avons pas encore assez de recul pour savoir si l’application de ce test simple permettra l’obtention d’un pourcentage correct de grossesses évolutives. Si tel n’est pas le cas ; et pour les spermes ne réagissant pas au test hypoosmotique, il faudra envisager le recours aux prélèvements de biopsies testiculaires ; et/ou essayer d’identifier un ou plusieurs facteurs paternels qui pourraient agir négativement sur le développement embryonnaire (facteurs génétiques, centriole anormal, anticorps anti spermatozoïdes etc…)

Le profil des anomalies des spermatozoïdes n’a pas toujours la même valeur. Il peut comporter une forte prédominance d’une anomalie donnée ou au contraire une grande diversité d’anomalies. Quand le pourcentage de formes atypiques est élevé ; le biologiste qui espère toujours pouvoir injecter des spermatozoïdes paraissant morphologiquement " normaux " se demande quelles sont les formes anormales qu’il peut injecter sans compromettre la fécondation et le développement ultérieur de l’embryon ? D’ores et déjà quelques études permettent de dire qu’il faut éviter d’injecter certaines formes anormales de spermatozoïdes.

Les patients ayant un syndrome pur de spermatozoïdes microcéphales à tête ronde (globozoospermie) ont un taux de fécondation réduit ou nulle en ICSI. Malgré cela, quelques grossesses évolutives ont été obtenues avec ce type de stérilité (tableau7) . La pratique de l’ICSI dans un système hétérologue homme-souris a permis à RYBOUCHKIN et Coll, 1996, de mettre en évidence une absence de capacité des spermatozoïdes microcéphales à activer les ovocytes ; indépendante de la forme et de la taille exacte du spermatozoïde microcéphale injecté (0% d’activation ovocytaire contre 95% avec des spermatozoïdes normaux de donneurs) ( tableau 8). Dans cette même étude l’analyse du caryotype de ces spermatozoïdes montre qu’il ne présente pas plus d’anomalies (6%) que celui des spermatozoïdes normaux (9%). L’échec de fécondation chez ce patient pourrait donc être dû à une déficience en " Oscilline " des spermatozoïdes.

Il n’y a pas de preuves pour affirmer que les spermatozoïdes anormaux sont génétiquement anormaux. L’injection de spermatozoïdes humains dans des ovocytes de souris permet de corréler la morphologie de la tête spermatique avec son contenu chromosomique.

C’est ainsi que LEE et Coll, 1996, ont montré une augmentation du taux d’anomalies de structure des chromosomes dans les spermatozoïdes à têtes allongées ou à contour très irrégulier ( 26,1% d’anomalies contre 6,9% pour les spermatozoïdes à têtes normales). Cette étude doit être confirmée par des effectifs plus importants et doit nous inciter à éviter l’injection de ce type de spermatozoïdes.

En présence d’une azoospermie ; on a recours à un prélèvement épididymaire ou testiculaire pour obtenir des spermatozoïdes ; Lorsque l’azoospermie est d’origine sécrétoire ; même si le taux de FSH est élevé et les testicules petits (moins de 15 ml à l’orchidomètre) ; il est possible de trouver quelques spermatozoïdes dans les biopsies testiculaires. Néanmoins dans certaines situations, aucun spermatozoïde n’est visible et la question se pose de savoir s’il faut rechercher des spermatides (cellules haploïdes précurseurs de spermatozoïdes) pour réaliser la micro-injection.

On sait que chez l’animal (souris, lapin), l’injection de spermatides testiculaires fraîches ou congelées a permis la naissance de petits parfaitement normaux et fertiles (tableau 9).

Dans ces études, il s’agissait d’animaux fertiles alors que chez l’humain quelques naissances ont été obtenues à partir de spermatides d’hommes stériles présentant une azoospermie sécrétoire ( tableau 10).

Malgré des résultats obtenus chez les animaux et chez l’homme, montrant que la procréation avec spermatides fraîches ou congelées est possible ; cette procréation reste néanmoins peu efficiente.

L’étude de FISHEL et Coll, 1997, (voir tableau 11), comparant les taux de fécondation entre l’injection de spermatozoïdes et l’injection de spermatides chez 18 patients OAT sévères ou ayant une azoospermie sécrétoire, ; montre avec l’injection de spermatides l’obtention de seulement 24 à 30 % de fécondation contre 67 % avec les spermatozoïdes.

Il faut souligner d’autre part, que les rares succès obtenus chez l’humain concernent des hommes azoospermes ayant pû prouver dans le passé leur capacité à produire quelques spermatozoïdes matures ; donc ayant eu une spermatogénèse complète.

Quand cela est possible ; il semble donc préférable d’injecter des spermatozoïdes ; en attendant que la recherche progresse pour l’obtention, d’un meilleur taux de fécondation et de développement embryonnaire avec l’injection de spermatides.

Un des grands avantages de l’ICSI, est de pouvoir apprécier non seulement le stade de maturation nucléaire des ovocytes mais aussi de pouvoir noter leur morphologie au recueil. La dysmorphie ovocytaire peut se situer à différents niveaux de l’ovocyte :

- au niveau de la zone pellucide : de forme ou d’épaisseur anormales.

- au niveau du globule polaire : fragmenté ou de taille anormale

- au niveau de l’espace perivitellin : large ou comportant des granulations .

- des vacuoles

- des inclusions denses

- une accumulation de reticulum endoplasmique lisse

- une granularité excessive ou inhomogène.

D’après les travaux publiés sur l’ICSI il semble que le taux de fécondation des ovocytes dysmorphiques soit semblable à celui des ovocytes normaux (ALIKANI et Coll ,1995). Néanmoins, une étude plus récente de XIA 1997, montre que les ovocytes ayant un espace perivitellin normal et un cytoplasme dépourvu d’inclusions denses ont le taux de fécondation le plus élevé.

Que le taux de fécondation des ovocytes dysmorphiques soit normal ou abaissé, on s’interroge sur la capacité de ces ovocytes à assurer un développement embryonnaire normal. En effet, ALIKANI et Coll, 1995, ont montré que plus de grossesses biochimiques et d’œufs clairs pouvaient être obtenus avec des transferts d’embryons tous issus, d’ovocytes dysmorphiques, il serait donc intéressant de pouvoir repérer les dysmorphies ovocytaires responsables de la diminution du potentiel évolutif des embryons ( MANDELBAUM et Coll, 1997)

Tableau 1

TABLEAU 2

CYCLES ( C ) 127 86

OVOCYTES MATURES 920 630

OVOCYTES INTACTS 844 580

OVOCYTES FECONDES( 2PN/OV. INT) 554 (65,6%) 361 ( 62,2%)

EMBRYONS TRANSFERES 327 219

TRANSFERTS ( T ) 119 82

GROSSESSES CLINIQUES (G) 47 30

% G/C 37% 34,9%

% G/T 39,5% 36,6%

Laboratoire d’Eylau

Tableau 3

Tableau 4

COUPLES 15 16

CYCLES 16 19

OVOCYTES MATURES 95 119

OVOCYTES INTACTS 76 (80%) 106 (89%)

OVOCYTES FECONDES(2PN/OV. INT) 46 (60,5%) 60 (56,6%)

EMBRYONS TRANSFERES 36 39 ( 2,3 E/T)

TRANSFERTS 16 17

GROSSESSES CLINIQUES- 2 - FCS 6 - 1 FCS

- MIU - 1 ITG pour anencéphalie